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本文引用：叶坤, 雷敏, 谢欣, 郑晖, 陈敏, 余曙光. 基于网络药理学与分子对接技术探讨黄芪建中汤治疗腹泻型肠易激综合征的作用机制研究. 中国全科医学[J], 2022, 25(15): 1814-1824 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2022.02.014
YEKun, LEIMin, XIEXin, ZHENGHui, CHENMin, YUShuguang. Mechanism of Huangqi Jianzhong Decoction in Treating Diarrhea Predominant Irritable Bowel Syndrome Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Technology. Chinese General Practice[J], 2022, 25(15): 1814-1824 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2022.02.014
目前肠易激综合征（IBS）全球患病率为10%~15%，中国为1.4%~11.5%[1,2]。IBS是一种身心共患病，反复发作不仅给患者的工作和生活带来严重影响，对患者精神心理也有不同程度的损害[3]。最新的罗马Ⅳ标准将IBS分为4个亚型，其中腹泻型肠易激综合征（IBS-D）最常见，占40%~45%[4,5]。IBS发病机制复杂，涉及脑肠交互紊乱、遗传因素、肠道炎症和菌群紊乱、内脏高敏感性以及肠道动力异常等。因此，国际上对于IBS的治疗，主要以泻药、止泻药、解痉剂以及抗抑郁药等为主，但效果欠佳，且药物的长期疗效尚不能确定[6]。
IBS-D属于中医学的腹泻、腹痛范畴，与”大肠泄””痛泄”等有联系[7]，其多是因先天禀赋不足和/或后天失养，加之情志失调、饮食不节以及感受外邪而导致，病位涉及肝、脾（胃）、肾等脏腑，与心和肺亦有关系[8]。IBS-D主要病机为肝郁、脾虚、肾阳不足，临床治疗以抑肝补脾、渗湿止泻，必要时佐以温补肾阳[9]。《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治》述黄芪建中汤云：”虚劳里急，诸不足，黄芪建中汤主之。”本方含黄芪、桂枝、白芍、生姜、甘草、大枣、饴糖，其中黄芪甘温，补气升阳举陷；桂枝味辛、甘温，温通经脉、补心肾脾之阳气；白芍甘、酸、微寒，平抑肝阳、柔肝止痛；生姜辛温以温中散寒；甘草甘平以益气补脾、缓急止痛；大枣甘温能补中益气；饴糖甘温可补脾益气、缓急止痛。诸药合用，共收柔肝止痛、温中健脾止泻之功。临床运用黄芪建中汤治疗IBS-D较为普遍且疗效肯定，有较多研究表明，与对照组相比，黄芪建中汤对IBS-D的疗效优势具有统计学意义[10,11,12]。但目前关于黄芪建中汤治疗IBS-D的确切机制尚不十分明确，相关研究亦不多见。
运用中药及中药复方治疗、预防疾病在我国已经有几千年的历史。随着现代科技的进步，医学相关的其他学科如生物学、蛋白组学、基因组学等发展迅速，为中医药治疗疾病的微观机制研究提供了便捷。鉴于黄芪建中汤治疗腹泻型肠易激综合征（IBS-D）临床有效，且具体作用机制尚不十分明确，本文运用网络药理学对黄芪建中汤治疗IBS-D的微观机制进行预测并进行分子对接验证，为实验研究提供思路，也为黄芪建中汤治疗IBS-D提供一定依据。
网络药理学这一概念是英国Hopkins教授于2007年提出，在近些年成为中药药理基础与作用机制研究的热门工具[13,14]。基于上述背景，本研究拟借助网络药理学和分子对接，预测黄芪建中汤在IBS-D治疗中的有效化合物、潜在的作用靶点及信号通路，为进一步探究黄芪建中汤治疗IBS-D的作用机制提供研究方向。
1 资料与方法1.1 黄芪建中汤有效活性成分与作用靶点的搜集与筛选
利用TCMSP数据库[15]（https://www.tcmsp-e.com/）对黄芪、桂枝、白芍、生姜、甘草、大枣、饴糖进行相关活性成分筛选及靶点预测。药物活性成分筛选条件为：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%；类药性（drug-likeness，DL）≥0.18[16]。删除药物的重复靶点，得到最终靶点集，导入Uniprot数据库[17]（http://www.uniprot.org/），限定物种为人（已验证），对靶点名称进行标准化。
1.2 IBS-D的靶点获取
使用GeneCards[18]（https：//www.geneca-rds.org/）、OMIM[19]（https://omim.org/）、TTD[20]（http://db.idrblab.net/ttd/）、Drug Bank[21]（https://go.drugbank.com/）、PharmGKB[22]（https://www.pharmgkb.org/）数据库，检索”diarrhea irritable bowel syndrome”，筛选IBS-D相关靶点基因集。将删除重复靶点的最终疾病靶点导入Uniprot数据库，对靶点名称进行标准化。
1.3 绘制”药物-活性成分-靶点”网络图
对疾病靶点和药物靶点利用R语言中的Venn程序进行映射取交集，绘制韦恩图；使用Cytoscape 3.8.1软件[23]绘制”药物-活性成分-靶点”网络图，利用内置工具Network Analyzer分析网络的拓扑参数，依据节点连接度值（degree）筛选核心活性成分。
1.4 构建黄芪建中汤治疗IBS-D靶点的蛋白相互作用（PPI）网络
为探究黄芪建中汤药物相关靶点与IBS-D靶点间的相互作用，将交集靶点导入String数据库[24]（https://string-db.org/），物种设置为”Homo Sapiens”，构建PPI网络，隐藏游离靶标，设定PPI分值为0.4，下载TSV格式文件并导入Cytoscape 3.8.1，绘制PPI网络图。Network Analyzer用于网络的拓扑参数分析，中心度值（betweenness centrality）、紧密中心度值（closeness centrality）、节点连接度值（degree）用于筛选核心靶点。
1.5 基因本体论（GO）功能和京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析
将黄芪建中汤治疗IBS-D的靶基因上传至Metascape数据库[25]（http://metascape.org/gp/in dex.html），物种设置为”Homo Sapiens”，选择”Custom Analysis”，分别进行GO功能和KEGG信号通路富集分析，以P<0.01为差异有统计学意义。GO功能富集分析包括生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）。参数设置为最小重叠>3，值截止<0.01，最小富集>1.5。选择排名前20位的GO功能和KEGG信号通路上传到BioLadder生信云平台（https://www.bioladder.cn/）绘制气泡图，对数据进行可视化，并采用Cytoscape 3.8.1绘制”药物-活性成分-靶点-疾病-信号通路”图。
1.6 分子对接验证
核心小分子化合物作为配体，从Pubchem数据库[26]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索化合物CAS号，下载3D结构，用Chem3D pro[27]使其能量最小化，保存为mol2格式。核心靶点作为受体，从PDB数据库[28]（https://www.rcsb.org/）下载核心靶点的三维结构（PDB格式），核心靶点蛋白选择遵循原则：（1）人源蛋白；（2）分辨率高；（3）优先选择具有原始配体[29]。使用PyMOL 2.4.1软件对核心靶点蛋白进行去除水分子和原始配体。利用AutoDock软件[30]将核心靶点加氢并转换为pdbqt格式，同时设置小分子化合物旋转键后保存为pdbqt格式，然后，运用AutoDock Vina 1.5.6软件[31]进行对接，结果用PyMOL软件进行可视化，输出三维图，并做热图分析。
2 结果2.1 黄芪建中汤活性成分与作用靶点
以OB≥30%，DL≥0.18为标准检索TCMSP数据库，筛选得到142种活性成分，其中甘草88个、大枣19个、黄芪17个、白芍8个、桂枝6个、生姜4个，饴糖未在TCMSP数据库中检索到活性成分，通过查阅文献补充葡萄糖、糊精、麦芽糖3个化合物，均未满足筛选标准，故删除。其中共有活性成分11个，删除活性成分中的重复项和不能在Uniprot数据库找到official symbol的活性成分后，最终得到123个活性成分，选取共有活性成分11个进行展示，见表1。在TCMSP数据库中选取”RelatedTargets”模块，获得247个黄芪建中汤活性成分对应的靶点。
2.2 IBS-D相关靶标的收集及黄芪建中汤治疗作用靶点的筛选利用
检索Gene Cards、OMIM、TTD、Drug Bank及PharmGKB数据库，去除重复靶点后获得3 486个与IBS-D相关靶点，将药物靶点映射到疾病靶点中，最终获得黄芪建中汤治疗IBS-D的潜在作用靶点180个，见图1（彩图扫描文章首页二维码）。
Figure 1
Figure 1 Venn diagram of drug-IBS-D intersected targets
2.3 ”药材-活性成分-靶点网络图”的分析
利用Cytoscape对180个交集靶点进行”药材-活性成分-靶点”网络图的绘制，该网络有306个节点，其中6个药材节点、121个化合物节点、180个靶点节点，2 396条边，见图2。根据Network Analyzer计算网络中的拓扑参数，筛选中心度值、紧密中心度值、节点连接度值较大的节点，这些节点在整个网络中起到枢纽的作用，可能是关键的化合物或者靶点[32]。每个靶点平均与12.53个化合物相互作用，每个化合物平均与14.94个靶点相互作用，体现了中药多成分与多靶点共同作用的整体性和联系性的特点[33]。通过筛选得出前8名的活性成分：槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、刺芒柄花素、豆甾醇、毛蕊异黄酮、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇度值，除7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇只为黄芪活性成分外，其余均为共有活性成分，见表2。依据节点连接度值（degree）调节网络中靶基因的面积大小，由图2可知PTGS2、HSP90AA1、雌激素受体1（ESR1）、PPARG、AR、NOS2、PTGS1、NCOA2、PRSS1、SCN5A、CDK2等靶基因度值较大。
Figure 2
Figure 2 Network of herbals-active ingredients-targets
2.4 黄芪建中汤治疗IBS-D潜在作用靶点互作网络构建与分析
基于String数据库获取黄芪建中汤治疗IBS-D靶点间的互作信息，下载TSV文件，导入Cytoscape 3.8.1进行可视化及分析，得到PPI网络，见图3A，该网络包括180个节点、3 762条边，通过Network Analyzer分析，得到紧密中心度值平均值为0.543 096 779、节点连接度值平均值为41.8、中心度值平均值约为0.004 9，以节点连接度值≥83.6、中心度值≥0.009 92为条件进行筛选，得到核心网络（图3B）。依据PPI网络图，度值排名前10位的核心靶标为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素（IL）-6、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、IL-1B、表皮生长因子受体（EGFR）、连环蛋白β1（CTNNB1）、转录因子AP-1（JUN）、ESR1，见表3。
Figure 3
Figure 3 PPI network of potential targets of Huangqi Jianzhong Decoction in treatment of IBS-D
2.5 GO功能和KEGG信号通路富集分析
GO功能富集分析中BP分析获得2 376个条目，前3条为response to inorganic substance（对无机物质的反应）、response to lipopolysaccharide（对脂多糖的反应）、response to xenobitic stimulus（对异种刺激的反应）；CC分析获得115个条目，前3条为membrane raft（膜筏）、plasma membrane protein complex（质膜蛋白复合物）、apical part of cell（细胞顶端）；MF分析获得194个条目，前3条为transcription factor binding（转录因子结合）、protein kinase binding（蛋白激酶结合）、protein domain specific binding（蛋白质结构域特异性结合）；选取BP、CC、MF分析中最为显著的20个过程绘制GO功能分析图，见图4。KEGG信号通路富集分析共获得352条信号通路，选取最为显著的20个过程绘制KEGG信号通路富集分析图，见图5。使用Cytoscape 3.8.1绘制”药物-活性成分-靶点-疾病-信号通路”图，见图6。
Figure 4
Figure 4 GO enrichment analysis of potential targets of Huangqi Jianzhong Decoction in treatment of IBS-D
Figure 5
Figure 5 Enrichment analysis of KEGG signal pathway of potential target of Huangqi Jianzhong Decoction in treatment of IBS-D
Figure 6
Figure 6 Network of drug-active ingredients-key target-IBS-D-signaling pathway
2.6 分子对接
利用AutoDock软件将”活性成分-靶点”网络图中度值最高的8个活性成分（槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、刺芒柄花素、豆甾醇、毛蕊异黄酮、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇）与PPI网络图中8个核心蛋白（AKT1、TP53、TNF、IL-6、CASP3、IL-1B、EGFR、CTNNB1）进行分子对接。配体和受体结合能越低，结合越稳定，两者结合能≤-5.0 kcal/mol说明两者可以结合，≤-7.0 kcal/mol说明有较好的结合能力[34]。结果表明8个核心蛋白和8个活性成分结合能均≤-6.0 kcal/mol，见表4。将对接结果导入PyMOL软件进行视觉优化，输出三维图，部分活性成分和蛋白分子对接图见图7。
Figure 7
Figure 7 Part of the active ingredients and protein molecular docking diagram of Huangqi Jianzhong Decoction in the treatment of IBS-D
3 讨论
本研究运用网络药理学和分子对接技术的研究方法，探索黄芪建中汤治疗IBS-D的作用机制，据”药材-活性成分-靶点”网络图，发现黄芪建中汤主要活性成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、刺芒柄花素等。槲皮素作为黄酮类化合物的一个亚类，广泛存在于植物界中，拥有多种药理活性，例如抗炎、抗氧化、镇痛等[35,36]。5-羟色胺（5-HT）作为一种广泛存在人体中枢神经及胃肠道中的脑肠肽，与内脏疼痛及胃肠道动力异常相关，IBS-D患者血清5-HT水平显著高于正常者，初始感觉和持续排便阈值及最大耐受容量明显低于正常者[37,38]。研究发现，槲皮素可降低结肠5-HT水平、肠嗜铬细胞数量，减轻炎症诱导型肠易激综合征（PI-IBS）大鼠的内脏高敏感性及内脏运动反应[39]。IBS-D患者的结肠上皮通透性增加，槲皮素调节IBS模型大鼠细胞因子TNF-α的含量和紧密连接蛋白claudin-1、occludin的表达，改善肠上皮细胞通透性，增强肠屏障功能[40]。槲皮素还表现出一定的调节肠道微生物、抗焦虑和抗抑郁的作用[41,42]。山柰酚是一种广泛存在于蔬菜、中草药中的黄酮类物质，具有抗菌、抗炎、抗氧化、神经保护等药理活性[43]。山柰酚可对Toll样受体4（TLR4）、核因子κB（NF-κB）和STAT信号通路起到负调控的作用，显著降低脂多糖（LPS）诱导的大鼠肠道微血管内皮细胞TNF-α、IL-1B、IL-6的过度分泌，减轻炎症[44]。槲皮素和山柰酚均可通过调控Ca2+通道，抑制大鼠结肠纵肌的自发收缩，达到解痉作用[45]。β-谷甾醇具有抗炎、抗抑郁、抗氧化等生物活性[46]。β-谷甾醇可抑制TLR4和NF-κB的过度表达、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的活化，下调细胞中TNF-α、IL-1B、IL-6、IL-8的生成[47,48]。异鼠李素可提高痛阈值，其机制可能与抑制NF-κB通路，继而减少一氧化氮（NO）、TNF-α、IL-1及IL-6的表达、合成或释放有关[49]。在前8位活性成分中，黄芪占6味，其次是甘草占5味，推测黄芪有可能是黄芪建中汤治疗IBS-D的核心中药，与原方君药地位相符。
通过PPI网络图，筛选得出黄芪建中汤治疗IBS-D的关键靶点有AKT1、TP53、TNF、IL-6、IL-1B等，体现出中药治疗的多靶点特点。AKT1作为AKT的亚型，参与代谢、生殖、细胞存活、生长以及血管生成等在内的多种生物学过程，AKT是治疗IBS的主要焦点分子，而AKT1作为AKT的同源基因，推测其应与IBS有密切联系[50,51]。TP53作为一种常见的突变基因，与早发性癌症的易感性有密切关系，但目前尚无研究表明其与IBS-D的发生有联系[52]。关于IBS的发病机制，近年发现低度炎症和免疫激活在一定程度上参与了该病的发生、发展[53,54]。TNF-α、IL-6、IL-1B为促炎因子，有研究显示采用慢性束缚联合番泻叶灌胃法建造的小鼠模型相较空白对照组血清、结肠TNF-α、IL-6、IL-1B均增高，表明痛泻药方可降低结肠组织TNF-α、IL-6、IL-1B表达，抑制炎症，治疗IBS-D[55,56]。
KEGG通路富集分析发现，MAPK、NF-κB、cAMP和雌激素信号通路等为主要治疗通路。MAPK信号通路是体内调节炎性反应及免疫应答的重要通路，分为p38 MAPK、细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2、c-Jun氨基末端激酶（JNK）亚型通路[57]。MAPK信号通路在维持肠道局部黏膜免疫稳态、参与调控肠道局部免疫细胞的功能和调节内脏高敏性均发挥重要作用[58]。通过对IBS-D患者中有差异表达的基因进行pathway富集分析，发现MAPK信号通路有显著差异性变化[59]。研究表明p38 MAPK信号通路在机体疼痛感知、胃肠动力功能紊乱和免疫性炎症异常激活中均有重要的作用[60]，研究发现MAPK-ERK信号通路或许是导致IBS-D内脏高敏性的机制之一，痛泻要方改善IBS-D临床症状可能是通过调控MAPK-ERK信号通路、p38 MAPK，缓解IBS-D的内脏高敏性，减轻结肠的炎性反应[59]。cAMP信号通路与NF-κB信号通路均参与IBS-D的发生，其中cAMP信号通路被抑制，NF-κB信号通路活化，抑制NF-κB信号通路，激活cAMP信号通路可有效改善IBS-D症状[61]。NF-κB信号通路对于IBS-D的肠道炎症和内脏高敏性有重要作用[62]。IBS患者以女性多见，女性IBS患者外周血中雌二醇含量显著低于健康对照组，肠黏膜中雌激素受体的表达显著高于健康对照组[63]。
根据分子对接结果，核心蛋白与核心活性成分的结合能均≤-6 kcal/mol，表示黄芪建中汤核心化合物与核心受体蛋白稳定结合，可起到治疗IBS-D的作用，其中AKT1、EGFR与活性成分对接结果较好，提示AKT1、EGFR可能与IBS-D有一定联系，但目前关于这2个靶点与IBS-D的关联研究极少。
本研究利用网络药理学探讨黄芪建中汤治疗IBS-D的机制，验证了中药复方多途径、多靶点、协调治疗疾病的过程。黄芪建中汤可能通过活性成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、刺芒柄花素、豆甾醇、毛蕊异黄酮、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇与AKT1、TP53、TNF、IL-6、CASP3、IL-1B、EGFR、CTNNB1等蛋白相结合，进一步调节MAPK、NF-κB、cAMP、雌激素等信号通路，从而增强肠屏障功能、降低内脏敏感、减少炎性反应、调节肠道菌群，治疗IBS-D。
本文无利益冲突。
本文表格略
参考文献略
基于网络药理学与分子对接技术探讨黄芪建中汤治疗腹泻型肠易激综合征的作用机制研究
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