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单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种食源性致病菌，在许多食品供应链中普遍存在，能够在低水分活度、高渗透环境和低温等条件下生存。单增李斯特菌能够引起脑膜炎、败血症等严重的李斯特菌病，给食品工业造成经济损失，对人类健康造成严重威胁。细菌生长过程中形成的生物被膜是病原体的持久来源，它使细菌对消毒剂等耐受性变强，能够耐受高渗环境和冷冻环境等，对食品安全造成严重威胁。在食品工业中，控制单增李斯特菌生物被膜的形成是防止其污染的重要环节。
当环境中细菌浓度达到一定阈值时，群体感应系统能够调控菌体中相关基因的表达，从而调控多种生物行为，包括细菌生物被膜的形成、耐药性等，增强了细菌对不利环境的耐受性，使其在食品加工环境中变得难以清除，所以干扰群体感应系统是控制生物被膜形成的一个新方向。因此，南京农业大学食品科学与技术学院的张心怡、陆兆新、别小妹*等通过探索单增李斯特菌群体感应系统对其生物被膜形成的调控机制，旨在为控制单增李斯特菌的污染提供理论基础。
1、单增李斯特菌群体感应系统基因在生物被膜形成各时期的表达量
通过分析发现，在强生物被膜形成能力菌株LMB33426中，被膜态的agrD、luxS基因表达量显著高于浮游态。培养24 h，agrD在被膜态细胞中的表达量比浮游态提高了36 倍，在第36小时，luxS基因在被膜态细胞中的表达量比浮游态提高31 倍，这表明它们可能在生物被膜形成的过程中起到了正向调控的作用。另外，agrA基因和agrB基因在不同生长阶段的表达量相对浮游态无明显提高，而agrC基因在生长过程中的相对表达量均低于浮游态（图1A）。在FSIS57034菌株中，培养时间为24 h，agrD基因的相对表达水平比浮游态高21 倍；培养时间为36 h和48 h，luxS基因的相对表达水平分别比浮游态高2.6 倍和5.8 倍；总体来看，agrA/B/C的相对表达水平低于浮游菌（图1B）。在2 株生物被膜形成能力弱的菌株中，ATCC19116菌株的agrD基因在36 h相对表达水平最低，是浮游态的2%（图1C）。在CICC21662菌株中，从总体来看agrC基因的相对表达量最低，其次是luxS基因和agrD基因（图1D）。综上，可以看出，在强生物被膜形成能力的菌株当中，agrD和luxS基因相对表达量较高。在生物被膜形成的过程中，agrD和luxS基因可能发挥着主要的正向调控作用，通过构建基因缺失株来进一步研究群体感应系统在单增李斯特菌生物被膜形成过程中的调控作用。
2、单增李斯特菌ΔagrD突变株和ΔluxS突变株的构建
通过PCR鉴定突变株的构建是否成功，使用引物luxS-F1/R2扩增野生株时，目的条带为1 531 bp（图2泳道1），扩增ΔluxS缺失株基因组获得片段为1 122 bp（图2泳道2）；使用agrD-F1/R2引物扩增野生株的基因组时，目的片段为1 348 bp（图2泳道3），扩增ΔagrD缺失株基因组获得片段为1 186 bp（图2泳道4）。对所获得的PCR产物进行测序，结果表明单增李斯特菌Lm-ΔluxS和Lm-ΔagrD构建成功。
3、单增李斯特菌野生株和突变株生物被膜形成能力
图3表明，与野生株LMB33426相比，ΔluxS基因突变株的生物被膜形成能力减弱，ΔagrD基因突变株的生物被膜形成能力显著下降。这3 株菌的生物被膜形成能力在前36 h的培养过程中均表现为上升的趋势，在培养至36 h生物被膜形成能力最强，36 h后生物被膜形成能力开始下降。培养时间为24 h，ΔluxS和ΔagrD突变菌株的生物被膜形成能力下降显著，与野生株存在极显著差异（P＜0.01）；培养时间为48 h和60 h，ΔluxS基因突变株的生物被膜形成能力均显著低于野生株。在培养时间为24～60 h区间内，ΔagrD基因突变株的生物被膜形成能力也显著低于野生株。在培养时间达到72 h，不同菌株生物被膜形成能力之间的差异消失，且生物被膜生成量较低，这可能是此时已到达生物被膜的脱落阶段。
4、激光共聚焦显微镜观察野生株和突变株的生物被膜
通过SYTO 9和PI荧光染料染色，可使生物被膜中的活菌呈绿色荧光，而受损或死亡细胞呈红色荧光。对生物被膜进行荧光染色后发现LMB33426野生株形成的生物被膜厚度较厚，结构紧密，部分连成片（图4）。与野生株相比，ΔluxS菌株绿色荧光的数量及密集程度比野生株低，形成的生物被膜厚度均匀且较野生型薄；ΔagrD菌株绿色荧光的数量及密集程度明显降低，形成的生物被膜分散，且显著少于野生株。
5、单增李斯特菌野生株和突变株运动能力
试管穿刺实验中（图5A），在37 ℃下ΔluxS和ΔagrD突变株的穿刺线周围都有明显的白色扩散圈，且ΔagrD突变株的扩散范围明显宽于野生株，说明agrD基因的缺失导致LMB33426菌株在37 ℃下的运动性增强；在30 ℃下，野生株和突变株的穿刺线周围有白色扩散圈，且3 株菌的扩散范围接近，说明该温度下群体感应系统对LMB33426的运动性未产生显著影响。
泳动及爬动实验中，在37 ℃下，ΔluxS和ΔagrD基因突变株在0.3%的半固体培养基上都能够形成泳动圈，且扩散范围宽于野生株LMB33426（图5B 1 ）。ΔagrD基因突变株在37 ℃下形成的泳动圈直径显著宽于野生株，表现出比野生株更强的泳动能力（图5C），这表明在37 ℃时luxS、agrD基因的缺失使得LMB33426菌株的运动性增强。在30 ℃时，ΔluxS和ΔagrD突变株穿刺线周围的扩散范围与野生株无显著差异，这表明在30 ℃时野生株及基因缺失株的运动性无明显差异（图5B 3 、C）。另外，野生株和基因缺失株在37 ℃和30 ℃下都不能形成爬动圈（图5B 2 、B4）。
6、单增李斯特菌野生株和突变株疏水性的测定
2 个基因突变菌株的疏水性均低于野生株，其中ΔluxS基因突变株的疏水性与野生株无显著差异，而ΔagrD基因突变株的疏水性极显著低于野生株（P＜0.01）（图6），这与3 株菌生物被膜形成能力的趋势一致。以上结果表明，群体感应系统可能通过改变菌株的疏水性调节其生物被膜的形成能力。
7、单增李斯特菌野生株和突变株耐药性的测定
野生株和突变株对各抗生素的MIC及MBC值见图7。单增李斯特菌对喹诺酮类和氨基糖苷类、四环素类抗生素比较敏感，如CIP和GEN、OT比较敏感，对β-内酰胺类抗生素、磺胺类抗生素比较耐受，如CRO、CFP、SF。luxS、agrD基因的缺失使得菌株在浮游态和生物被膜态下对SF的MIC值显著降低。另外，agrD基因的缺失使得菌株对头孢曲松钠的MIC及MBC值降低。但是整体来看，luxS和agrD基因的缺失并没有对菌体的耐药性产生显著的影响。
结论
结果表明，与野生株相比，ΔagrD突变株和ΔluxS突变株的生物被膜形成能力下降；ΔagrD突变株的疏水性显著下降，在37 ℃下的泳动能力较野生株增强；群体感应系统基因敲除对菌株的耐药性没有产生较大影响。基因缺失株的构建为进一步研究群体感应系统对单增李斯特菌生物被膜形成的调控机制提供参考，同时为单增李斯特菌的预防控制奠定了基础。
通信作者简介
别小妹，女，中共党员，南京农业大学食品科技学院教授，博士生导师。主要从事食品微生物与生物技术，食源性致病菌安全控制研究。美国加利福尼亚大学戴维斯分校(UCDavis)微生物与分子遗传系访问学者。南京农业大学“钟山学者计划”学术骨干。主持国家自然科学基金面上项目、国家“863”计划项目、“十二五”国家科技支撑计划课题、“十三五”国家重点研发计划-子课题和江苏省科技项目等，发表SCI论文100余篇(通讯作者及合作作者)。参加获得教育部科技进步二等奖1项和江苏省高等教育教学成果二等奖1项。负责国家标准样品研制项目立项2项。参加《食品微生物学》和《食品安全》国家级精品课建设，副主编及参编教材3部。主讲《食品生物技术》、《食品微生物学》和《微生物遗传育种学》等本科生课程。负责《现代食品微生物学》和《食品生物技术专题》研究生课程。
第一作者简介
张心怡，女，南京农业大学食品科技学院2020级硕士研究生。研究方向为食品微生物，研究课题为“信号分子对单核增生李斯特菌生物被膜形成的调控机制”。
本文《群体感应系统对单增李斯特菌生物被膜形成的影响》来源于《食品科学》2022年43卷18期105-112页，作者：张心怡，陆兆新，郑丽平，吕紫岩，周立邦，孟凡强，别小妹。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211002-006。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及百度图片。
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