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1966年，美国科学家Good 等人提出了一类有机小分子pH缓冲材料（统称为“Good’s buffers”）用于生物学研究。这类有机小分子具有特殊的化学结构：同时含有正、负电荷基团（图1）。这些正、负电荷基团能够作为共轭酸和共轭碱，协同地赋予其高效的pH缓冲性能。它可以使细胞培养基质在培养箱外放置数天却能保持稳定的pH，从而为针对细胞在培养箱外的各种实验和操作提供了足够的时间。因此，Good’s buffers在过去半个世纪中被广泛地应用于细胞/组织培养、病毒鉴定、疫苗生产以及蛋白质/组织存储等生物医学领域。
图1. 常用Good’s buffers化学结构示意图。
Good’s buffers自提出以来一直被认为是生物相容性非常优异的pH缓冲材料。然而，随着其应用范围的不断扩展，逐渐发现它们并非完美。近年来有学者发现：1）HEPES（代表性的Good’s buffer被广泛应用于细胞/组织的培养）会被细胞内吞，突破了之前对Good’s buffers“无细胞膜通透性”的认知；2）RPMI 1640培养基中加入HEPES缓冲材料后会显著加剧巨噬细胞溶酶体的自噬以及炎症信号的上调；3）HEPES在实验室环境正常照明的情况下会产生显著的细胞毒性。然而， HEPES缓冲材料在细胞培养过程中对细胞正常功能的扰乱以及严重的细胞毒性等系列副作用的产生机制尚不明确。
近日，南京师范大学沈健教授、刘平生教授团队首次从活性氧物种（ROS）的角度对HEPES产生系列毒副作用的机制进行了阐明（图2）：1）细胞培养基中的核黄素（RF）在可见光（普通清洁工作台1mW/cm2）下产生单线态氧（1O2）、羟基自由基（·OH）以及超氧阴离子（O2-），其中以1O2为主要产物；2）在HEPES（25 mM）存在的条件下，93.2%的1O2转化为过氧化氢（H2O2），3小时内导致培养基中H2O2的浓度提高了10倍，达到106.6 μM。同时，在细胞培养的过程中，经含有HEPES的培养基培养的细胞其细胞内ROS水平会显著上调，而且，具有类似结构的其他多种Good’s buffers均展现相当水平的细胞内ROS上调现象（图3）。该工作的详尽内容以“Zwitterionic betaines over HEPES as the new generation biocompatible pH buffers for cell culture”为题发表在生物材料领域顶级期刊Bioactive Materials (2023, 24, 376-386)之上。该工作不仅从根源上对在生物医用领域已经广泛应用半个世纪之久的传统pH缓冲材料逐渐暴露的毒副作用机制予以完整解析，基于两性离子材料特殊离子型结构探索其在pH缓冲材料领域的应用也将为性离子甜菜碱材料在生物医学领域的应用开辟新的方向。
该文章的第一作者（共同）是刘沛铭博士和孙锦博士，南京师范大学是第一通讯单位，刘平生教授和沈健教授为共同通讯联系人。该工作也得到了国家自然科学基金、江苏省自然科学基金、江苏省“六大人才高峰”、南京师范大学“青蓝工程”等项目的支持。
图2. 可见光照射条件下含有25mM HEPES以及甜菜碱型两性离子聚合物的RPMI 1640培养基中的ROS生成图。（A） 三种两性离子多甜菜碱聚合物（pSBMA、pMPC和pCBMA）和HEPES的化学结构。（B） 在没有细胞的普通清洁工作台（1mW/cm2）的可见光照射下，在RPMI 1640培养基中产生的H2O2的量。不含缓冲剂的RPMI 1640培养基为阴性对照。（C） 在模拟阳光（120mW/cm2）照射5分钟的RF溶液中检测到的1O2的ESR光谱。（D&E）由HEPES或pSBMA缓冲的RPMI 1640培养基中H2O2的形成作为可见光暴露时间和缓冲液浓度的函数。（F） HEPES介导产生外源性H2O2的机理示意图。
图3. 可见光照射条件下经含有25mM HEPES以及甜菜碱型两性离子聚合物的RPMI 1640培养的细胞其细胞内ROS生成图。经含不同缓冲液的RPMI 1640培养基中培养的L-02细胞中细胞内ROS产生的荧光照片（A）及其强度定量（B）。
H2O2在细胞信号传导中至关重要，因为它会影响但凡涉及氧化还原信号传的细胞代谢行为。同时，它被认为是细胞信号传导的“必要恶魔”，因为过量的ROS会明显损害了细胞的DNA、蛋白质和脂质。因此，正常哺乳动物细胞的细胞内H2O2水平被严格控制在0.001~0.7μM范围，而细胞外H2O2的水平位置在不超过4μM。鉴于HEPES的存在显著非正常外源性H2O2浓度呈数量级升高，团队进一步研究了其对正常细胞行为（细胞活力、细胞毒性和溶酶体自噬激活等）的潜在影响。
图4. HEPES介导的非正常ROS产生对细胞正常行为的影响。
实验结果表明多种Good’s buffer的确显著影响多种细胞的活性：1）经含 25 mM的HEPES、POPSO、MOPOSO的培养基培养的L-02 细胞活性显著下降至 53.8, 77.7, 50.5, 34.4%。同时，25 mM的HEPES 显著降低其他典型的贴壁/悬浮、正常/病理状态下的细胞的活性：同等条件下，RAW 264.7、NB4、 A549、以及Hela 细胞的活性分别下降83.3、56.6、50.3和77.8%；2）显著上调细胞溶酶体表达；3）明显导致细胞的凋亡（图4）。究其原因主要是因为HEPES将半衰期比较短的ROS转变成了能稳定存在的H2O2（图4E），一方面细胞培养介质中ROS半衰期的数量级增长，显著增加其氧化性能；另一方面，细胞内/外H2O2浓度的数量级地增长，显著扰乱细胞的正常代谢行为，同时带来了显著的细胞毒性。至此，基于大量的实验结果，首次从活性氧物种（ROS）的角度对HEPES产生系列毒副作用的机制进行了阐明。
在此基础之上，团队提出采用（磷胺、磺胺、羧胺）两性离子甜菜碱聚合物及小分子作为新型生物相容性pH缓冲剂的策略，并通过大量实验进行了验证（图2-4）。实验结果充分表明：1）两性离子甜菜碱材料具有较高的pH缓冲性能，其中羧酸两性离子材料具备最搞得pH缓冲指数。2）三种两两性离子甜菜碱材料与HEPES相比较，在同等条件下不会引起外源性非正常ROS的转换，进而从根源上消除对细胞正常代谢、正常功能的影响。有望成为新一代的真正生物相容的pH缓冲材料用于生物学的研究。
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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X22005242
来源：高分子科学前沿
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